诺卡菌病的诊断依据包括：存在免疫功能低下如艾滋病、长期使用糖皮质激素/免疫抑制剂、土壤/水接触史等易感因素；出现对应临床表现肺部受累者有发热、咳嗽、胸痛，可伴空洞，皮肤受累者出现脓肿、溃疡等；实验室可见标本涂片为革兰阳性、抗酸弱阳性的分枝状菌丝，培养出诺卡菌属，影像学提示特征性病灶。
诺卡菌病诊断流程包括
1.标本采集与涂片镜检
根据感染部位规范采集标本，如肺部感染留取痰标本、中枢神经系统感染采集脑脊液、皮肤及软组织感染取脓肿分泌物或坏死组织等。标本处理后行革兰染色和弱抗酸染色，镜下观察到革兰阳性、呈分支状纤细菌丝的特征性形态，可作为初步筛查依据，为后续检查提供方向。
2.分离培养与菌种鉴定
将处理后的标本接种至血琼脂培养基、沙保弱培养基等适宜培养基，置于适宜温度和环境下培养，观察菌落的形态、颜色、生长速度等特征；随后结合生化试验如糖类分解试验、触酶试验等进一步鉴定诺卡菌菌种，明确病原菌类型以指导后续治疗。
3.分子生物学检测
针对疑似诺卡菌病的标本，采用聚合酶链反应PCR技术检测诺卡菌的特异性基因如16SrRNA基因，该方法灵敏度高、特异性强，可有效解决部分诺卡菌生长缓慢、培养困难的问题，尤其适用于早期诊断或特殊部位感染的病例。
4.影像学与临床辅助评估
结合影像学检查如肺部感染行胸部CT、中枢感染行头颅CT或MRI，以及患者的免疫状态如是否存在长期使用糖皮质激素、器官移植、HIV感染等免疫缺陷基础，综合判断感染部位及严重程度，辅助完成最终诊断。
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